Este artigo mostra alguns cuidados no manuseamento das colunas de HPLC para preservar e estender a sua vida útil, maximizando o desempenho e obtendo os resultados desejáveis.
A coluna cromatográfica (de HPLC) é um componente muito importante nas técnicas realizadas num sistema de cromatografia líquida de alta eficiência. Por isso deve ser manuseada com algum cuidado.
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Comecemos por um conselho simples, mas que pode estar na origem de alguns problemas.
Manipule sempre a coluna cromatográfica com o máximo cuidado para evitar quedas ou choques que podem influenciar negativamente o empacotamento, criando volumes mortos e, em última instância, danificar a coluna.
Tenha em atenção que há casos em que a coluna cai, mas devido ao seu corpo metálico não é possível perceber se ocorreram estragos, no entanto, o enchimento pode ter descompactado.
Este cuidado é importante manter durante a sua utilização diária e especialmente no momento da sua instalação. Como veremos de seguida.
Durante a instalação da coluna no sistema, remova os parafusos que tapam as extremidades da coluna, está armazenada deste modo porque o solvente de armazenamento não deve evaporar, estando sempre presente no seu interior.
Depois, verifique que a ligação da coluna ao sistema está feita corretamente para evitar fugas.
Neste ponto, é importante garantir que os parafusos dos tubos que se ligam ao sistema e ao detetor estão corretamente apertados. Deve obter um encaixe perfeito, sem forçar a entrada do parafuso, mas também não deve deixar folgas. Caso contrário, o solvente vai pingar e a análise não está a ser efetuada nas condições necessárias.
Siga a direção correta das setas indicadas na colunas - para a ligar ao HPLC e ao detetor nesse sentido- para que o líquido faça o seu percurso no sentido correto.
Quando vem embalada na caixa, a coluna cromatográfica está preenchida com um solvente de armazenamento recomendado pelo fabricante para aquele enchimento.
Para equilibrar a coluna, na primeira injeção deve passar fluxo de solvente durante cerca de 30 minutos. Mas neste processo, o mais importante é garantir que a fase móvel utilizada é compatível com o solvente de armazenamento, senão dá-se um choque de solventes e podem ser criadas interações indesejadas.
Na primeira vez, ligue a coluna ao HPLC (sem estar ligada ao detetor) e passe um fluxo baixo do solvente. Certifique-se que a outra ponta da coluna apenas se encontra ligada ao tubo que liga ao detetor, senão o líquido vai passar, desnecessariamente para o detetor e pode danificá-lo. De seguida e de forma gradual, deve ir aumentando o fluxo até ao valor desejado. Quando alcançar este valor, ligue o tubo ao detetor. Este procedimento vai evitar que a pressão aumente de forma drástica na coluna e a danifique.
Antes de passar ao conselho seguinte, mais uma nota.
Utilize um copo ou uma garrafa para colocar o tubo enquanto equilibra a coluna, assim o líquido irá verter para o seu interior.
O intervalo de pH vem nas recomendações do fabricante para a utilização da coluna e determina a escolha das fases móveis a utilizar.
Caso ignore este passo, se os solventes utilizados forem muito ácidos para a coluna ou demasiado básicos, dependendo da gama de pH da coluna, vai obter um perfil cromatográfico errado. Correndo o risco de danificar a coluna permanentemente.
Após usar a coluna na análise, deve armazená-la no solvente indicado pelo fabricante nas instruções.
Para isso deve passar o fluxo desse solvente ou mesmo realizar um método de lavagem da coluna, em que se tiver utilizado na fase móvel algum aditivo como um tampão deve proceder passando um fluxo de água: solvente orgânico recomendado pelo fabricante, na proporção 50:50, durante cerca de 30 minutos e depois no fim apenas o solvente orgânico recomendado durante 15 a 20 minutos.
Só assim garante a qualidade das análises cromatográficas posteriores e preserva a coluna de possíveis danos causados pela precipitação de sais presentes no tampão ou de outros aditivos.
Para garantir a rastreabilidade da utilização da coluna para cada técnica, guardar sempre a coluna na caixa correta - que corresponde ao número de série - ou, em alternativa, identificar na caixa da coluna qual a técnica de cromatografia em que vai ser utilizada ou guardar um logbook das suas utilizações.
Caso tenha dúvidas, antes de iniciar o procedimento com a coluna, verifique se a caixa onde foi armazenada corresponde ao número de série da coluna. Isto porque é desaconselhável utilizar uma coluna para vários métodos cromatográficos.
Escolher a coluna cromatográfica correta é o primeiro passo para obter resultados de qualidade para a técnica que vai utilizar, mas há-que ter o mesmo nível de atenção durante a sua utilização.
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